引言
自然殺傷（NK）細胞在識別和殺死腫瘤和病毒感染的先天和后天免疫反應中扮演著關鍵的角色。因此，已有許多研究嘗試研發(fā)在體外激活和擴增NK細胞的方法，以用于和免疫細胞相關研究，而目前的方法包括使用細胞因子、化學試劑以及飼養(yǎng)細胞1， 其中細胞因子在調節(jié)NK細胞的活性中具有核心作用。據(jù)報道， IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IFN-γ被歸類為NK細胞的細胞毒性和增殖的活化細胞因子，并增強NK細胞對各種腫瘤的細胞毒性作用2。然而，這些激活NK細胞的細胞因子組合仍需研究人員進一步優(yōu)化。
此應用說明描述了使用康寧NK無血清培養(yǎng)試劑盒II快速擴增NK 細胞的步驟，以及能驗證該試劑盒的測試方法。該測試結果顯示康寧NK無血清培養(yǎng)試劑盒II能為研究人員制備擴增能力強、細胞活力好以及細胞毒性高的NK細胞提供支持。
該NK無血清培養(yǎng)試劑盒II中含有1瓶1 mL的包被培養(yǎng)基，1瓶50 mL 的基礎培養(yǎng)基，1瓶1,000 mL的擴增培養(yǎng)基和1個透氣性細胞培養(yǎng)袋。前兩個試劑被專門設計用于NK細胞的激活培養(yǎng)，而擴增培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)袋則被用于擴增NK細胞。NK激活培養(yǎng)基和擴增培養(yǎng)基均是采用優(yōu)質的試劑和符合良好生產規(guī)范（cGMP）級的原料制造的。培養(yǎng)基中存在的唯一蛋白質是可注射等級的血清白蛋白和重組人胰島素。
結果
NK細胞形態(tài)
樹突狀細胞附著在培養(yǎng)瓶表面上，而NK細胞經培養(yǎng)會形成較小的細胞團塊。該細胞團塊的體積會隨著細胞密度的上升而增加。圖1顯示培養(yǎng)第10天后NK細胞在不同培養(yǎng)基中的形態(tài)。NK培養(yǎng)試劑盒和NK無血清培養(yǎng)試劑盒II的培養(yǎng)液中觀察到的細胞團塊遠多于競爭產品I和競爭產品Y的培養(yǎng)基中觀察到的細胞團塊。
材料和方法
根據(jù)說明書使用淋巴細胞分離液（康寧目錄編號：25-072-CI）將外周血單個核細胞（PBMCs）從健康供體的血液中分離。
將3×107個細胞/mL的PBMC懸浮于20 mL的激活培養(yǎng)基（含10％自體血漿的NKCC-1培養(yǎng)基）中后轉移至預包被的T-75的培養(yǎng)瓶中， 隨后置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中在37℃下培養(yǎng)2-3天。T-75培養(yǎng)瓶在使用前均預先以NKCC-3培養(yǎng)基進行包被。
將10 mL的激活培養(yǎng)基（含10％自體血漿的NKCC-1培養(yǎng)基）加入該T-75培養(yǎng)瓶中后繼續(xù)培養(yǎng)細胞2天直至細胞密度達到2x106個細胞/mL以上。
懸液在800 ×g下離心5分鐘以收集所有PBMC細胞。將沉淀的細胞重新懸浮于含10%自體血漿的NKCC-2培養(yǎng)基中，再補充5%的自體血漿，并轉移至細胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)。每2-3天檢查細胞狀態(tài)，并加入新鮮的NKCC-2培養(yǎng)基將細胞密度維持在5×105至1×106個細胞
/mL的范圍內。培養(yǎng)14天后收集細胞進行細胞計數(shù)，同時利用BD AccuriTM C6流式細胞儀（BD Biosciences）分析細胞表面標志物
（CD3-/CD56+）的表達。此外，該NK細胞還通過CCK-8法，以K562作為靶細胞（效應細胞與靶細胞，即E/T的比率為5和10）檢測其細胞的毒性殺傷能力。
圖1. 培養(yǎng)10天后NK細胞的形態(tài)。培養(yǎng)于NK無血清培養(yǎng)試劑盒II、NK培養(yǎng)試劑盒、競爭產品I和競爭產品Y10天后的NK細胞。以上為隨機選擇的照片。比例尺：200 µm。
NK細胞的增殖和擴增
對于NK細胞的增殖，如圖2和圖3所示，NK細胞在分別利用NK無血清培養(yǎng)試劑盒II和NK培養(yǎng)試劑盒培養(yǎng)14天后擴增了230倍和200倍，總細胞數(shù)量分別為7 x 109個細胞和 6 x 109個細胞，比競爭產品I的培養(yǎng)試劑盒（只達到70倍的擴增）多了3倍。利用競爭產品Y的培養(yǎng)試劑盒培養(yǎng)的NK細胞呈比較差的擴增表現(xiàn)，這也與其細胞形態(tài)學觀察結果一致。
NK細胞的表型
NK細胞的特異表面標志物為CD3-/CD56+。流式細胞的分析結果 顯示使用NK無血清培養(yǎng)試劑盒II可獲得86.7％的NK陽性細胞，而使用競爭產品I和競爭產品Y的培養(yǎng)試劑盒則獲得相對較少的NK 陽性細胞（分別為66.1％和78.8％），數(shù)據(jù)如圖4所示。
CCK-8細胞毒性
將5×105個及1×106個效應細胞（NK細胞）/mL分別與1×105個靶 細胞（K562細胞）/mL在96孔微孔板（100 µL）中混合后置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中在37℃下隔夜共培養(yǎng)。分析前在每孔細胞均加入10 µL的細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）試劑（Sigma目錄編號：96992） 并進一步在37℃下孵育4小時后利用SpectraMax M4®（Molecular Devices）多功能微孔板檢測儀讀取吸光度數(shù)據(jù)。在E/T比例為5的狀況下，康寧NK無血清培養(yǎng)試劑盒II與競爭產品I（70％）和競爭產品Y（60％）相比具有更強的細胞毒性（100％）。
圖5.CCK-8法評估NK細胞對K562細胞的細胞毒性。該細胞毒性測定是在效應細胞（NK細胞）與靶細胞（K562細胞）的比例為5和10的情況下進行。
結論
 使用康寧NK無血清培養(yǎng)試劑盒II可快速激活擴增NK細胞，可獲取數(shù)量大（~70億細胞，即230倍的增殖），具有高細胞毒性效力（在E/T比例為5：1的狀況下達到100％的細胞毒性效力）的NK細胞。
康寧NK無血清培養(yǎng)試劑盒II在無其他細胞因子（如IL-2）的條件下可以獲取較高的NK細胞增殖。
康寧NK無血清培養(yǎng)試劑盒II具有一套完整的材料和詳細的操作程序。
與競爭產品I和競爭產品Y的培養(yǎng)試劑盒相比，培養(yǎng)于康寧NK 無血清培養(yǎng)試劑盒II的NK細胞在生長、NK陽性細胞比率以及細胞毒性效力方面均表現(xiàn)出了更好的性能。
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附錄
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項目 NK無血清培養(yǎng)試劑盒II
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NK培養(yǎng)試劑盒
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競爭產品I
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競爭產品Y
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4個組分:
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5 個組分:
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1個組分:
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8個組分:
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1L NKCC-2擴增培養(yǎng)基
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預包被的T75培養(yǎng)瓶
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NK培養(yǎng)基（2L/2瓶）
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NK培養(yǎng)基（2L/2瓶）
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50mL NKCC-1激活培養(yǎng)基
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1L的KBM NK擴增培養(yǎng)基
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NK誘導因子（6瓶）
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1 mL NKCC-3包被培養(yǎng)基
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50 mL的NK基礎培養(yǎng)基
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項目 透氣性細胞培養(yǎng)袋
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1.8 mL的基礎添加試劑
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透氣性細胞培養(yǎng)袋
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產品包裝體積 1L
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1L
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1L
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2L
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PBMC的細胞接種數(shù)量 30 千萬
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30 千萬
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30 千萬
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30 千萬
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培養(yǎng)天數(shù) 14
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14
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14
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14
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細胞產量 ~6.9 億
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~6.0 億
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~2.1 億
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~0.9 億
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擴增倍數(shù) 230
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200
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70
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29.3
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CD3-/CD56+比例 86.70%
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67.10%
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66.10%
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78.80%
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效應NK細胞數(shù)量 ~5.9 億
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~4.0 億
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~1.4 億
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~0.7 億
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細胞毒性（E/T=5） 100%
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75%
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72%
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68%
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培養(yǎng)基使用體積 1.5L
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1.5L
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1.5L
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800 mL
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IL-2使用體積（1000IU/mL） --
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1.5 mL
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1.5 mL
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--
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自體血漿使用體積 9.5 mL
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22 mL
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3.5 mL
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3.6 mL
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參考文獻
1. Zhang C, Zhang J, Niu J, Zhou Z, Zhang J, Tian Z. Interleukin-12 improves cytotoxicity of natural killer cells via upregulated expression of NKG2D. Hum Immunol 2008; 69:490-500.
2. Zhang C, Zhang J, Sun R, Feng J, Wei H, Tian Z. Opposing effect of IFN gamma and IFN alpha on expression of NKG2 receptors: negative regulation of IFN gamma on NK cells. Int Immunopharmacol 2005; 5:1057-67.
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