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ELISA是酶聯(lián)免疫吸附測定的簡稱，是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術。它以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合，由于抗原、抗體反應在一種固相載體— 一、試劑的選擇 優(yōu)良的檢測試劑對于結果準確的必要性不容置疑。注意操作嚴格按照試劑說明書進行，試驗前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。 二、加樣 (一)可能出現(xiàn)的問題 1．血清或血漿標本分離不好即進行加樣或者待檢標本污染或溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應。 2．手工操作中，加樣板過多造成加樣后放人孵箱前等待時間長(特別是室內(nèi)溫度較高時)，或者加樣不準確，各孔標本或試劑含量有差別。 3．加完標本再加酶試劑時酶濺出。 (二)解決方法 1．可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體液(如血清)、分泌物(如唾液)和排泄物(如尿液、糞便)等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進行測定(如血清、尿液)，有些則需經(jīng)預處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測均以血清為標本。標本為血清：最好將血液先于室溫放置1-2小時后，再用3000r／min離心lO分鐘；標本若為血漿，必須使用含抗凝劑的血液標本收集管，采血后立即顛倒采血管混合5-10次，放置一段時間后，3000r／min離心15分鐘。血清標本宜在新鮮時檢測，如在冰箱中保存過久，其中的蛋白質(zhì)可發(fā)生聚合，在間接ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標本可放置于4~C，超過一周測定的需低溫冰存。凍結血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混勻，宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和。 2．在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣后及時放入孵箱溫育。 3．從冰箱中取出的試劑應待溫度與室溫平衡后使用。加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。 4．標本較多時，請分批操作。 三、孵育 在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育。此過程中可能出現(xiàn)的問題有：孵育時未貼封片或加蓋，使標本或稀釋液蒸發(fā)．吸附于孔壁，難于清洗徹底。故應注意溫育的溫度和時間，應按規(guī)定力求準確，如果孵育時間人為延長，將導致非特異性結合緊附于反應孔周圍難以徹底清洗。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板。 四、洗板 洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELISA就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。采用手工洗板時，孔與孔之間液體交叉。采用半自動洗板機洗板時，洗液量不足可能導致洗板不徹底；洗板針堵塞，可能導致抽吸不完全；洗板不暢可能導致洗板效果差；反應板過多可能導致洗板等待時間長。以上情況均可造成結果誤差，解決的方法是保證洗液注滿各孔，洗板釘暢通，洗完板后最好在吸水紙(選擇干凈、無塵的吸水材料)上輕輕拍干；合理安排洗板時間，交替操作。 五、顯色 顯色是ELISA中的最后一步溫育反應，反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。顯色劑盡量在臨用前配制，不用過期顯色劑肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑堅決不用；當室溫較低時應適當延長顯色時間；加樣時保持顯色劑不外流以免造成液體回流；A、B液應避免接觸金屬器械。 六、終止 加終止液時產(chǎn)生較多氣泡，會導致假陽性增加，在操作中加以注意就能避免。 七、讀板 讀板時板底如不清潔也可能造成讀數(shù)不準。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15-30℃，使用前先預熱儀器l5～3O分鐘，測讀結果更穩(wěn)定。
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