0 引言
我國(guó)是世界第二大農(nóng)藥生產(chǎn)國(guó)，同時(shí)也是第一大農(nóng)藥消費(fèi)國(guó)。隨著各種農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及日常生活的廣泛應(yīng)用，有關(guān)農(nóng)藥殘留引起環(huán)境污染的事件日益增多，因此農(nóng)藥污染問(wèn)題成為急需監(jiān)測(cè)、治理的焦點(diǎn)之一。既往農(nóng)藥的檢測(cè)多采用氣相色譜法、液相色譜法等，這些方法需要昂貴的儀器設(shè)備、訓(xùn)練有素的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員，消耗試劑多，檢測(cè)成本高，而且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不利于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè) [1-3]。農(nóng)藥的免疫檢測(cè)技術(shù)因具有快速、靈敏、特異性高等優(yōu)點(diǎn)而引起相關(guān)研究人員和科研機(jī)構(gòu)的重視，成為農(nóng)藥檢測(cè)中一種簡(jiǎn)便、樣品通量大、檢測(cè)費(fèi)用低廉、適用現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)的分析方法 [4, 5]。毒死蜱(chlorpyrifos)，化學(xué)名稱(chēng)為O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯，作為我國(guó)“十一五”期間國(guó)家推廣使用的農(nóng)藥之一，它是一種高效、廣譜、中等毒性的有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)劑，具有觸殺、胃毒和熏蒸三種作用方式，是防治糧食、蔬菜和其他經(jīng)濟(jì)作物的理想殺蟲(chóng)劑，但它同時(shí)也對(duì)農(nóng)田環(huán)境及其有益生物產(chǎn)生了影響[6]，新近的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)毒死蜱與肺癌的發(fā)生可能存在某些聯(lián)系，而且有研究顯示其極可能具有內(nèi)分泌干擾作用[7]。隨著國(guó)內(nèi)甲胺磷、久效磷、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷等高毒有機(jī)磷農(nóng)藥的禁用，毒死蜱逐漸代替高毒農(nóng)藥，應(yīng)用范圍越來(lái)越廣[8]，其污染檢測(cè)問(wèn)題也隨之而來(lái)。制備毒死蜱單克隆抗體，建立毒死蜱的免疫檢測(cè)方法，可以有效地對(duì)毒死蜱殘留進(jìn)行監(jiān)控分析，減少毒死蜱中毒事件的發(fā)生。本研究合成毒死蜱人工抗原，制備毒死蜱單克隆抗體，初步建立了毒死蜱間接ELISA 檢測(cè)方法。
1 材料
1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞
BALB/C 小鼠，6-8 周齡，雌性（購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0（東南大學(xué)遺傳學(xué)研究中心提供）。
1.2 主要試劑
弗氏完全佐劑(Sigma 公司)、弗氏不完全佐劑(Sigma 公司)、辣根過(guò)氧化物酶-羊抗小鼠IgG(HRP-IgG，南京生興生物技術(shù)公司)、RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco 公司)、小牛血清(fetalcalf serum，F(xiàn)CS，杭州四季青公司)、20%小牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基、氨基喋呤(A)貯存液、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)貯存液、HAT 培養(yǎng)基、HT 培養(yǎng)基、青、鏈霉素溶液、50％聚乙二醇(PEG)溶液、PBS 緩沖液、包被液、洗滌液及稀釋液(PBS-T 溶液，pH7.4)、封閉液、底物溶液(TMB)、毒死蜱樣品溶液、正辛酸(分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司)、25-28%濃氨水(分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司)、殺螟硫磷、對(duì)硫磷、馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)品(江蘇省疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng))、60mmoL/L 乙酸緩沖液、20mmoL/LPBS 緩沖液、飽和硫酸銨溶液、毒死蜱溶液。
1.3 主要儀器
Ultraspec-4000 型紫外/可見(jiàn)分光光度儀(Pharmacia Biotech 公司)、HJ-3 型電磁攪拌器(常州國(guó)華電器有限公司)、低溫離心機(jī)(HITACHISCR20BC)、DOA-P181-BN 型抽氣泵(GelmanLaboratory)、SK-1 型快速混勻器(常州國(guó)華電器有限公司)、TGL-16 型高速臺(tái)式離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)、LD5-2A 型低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)、SW-CJ-2F 型凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、IX51 型倒置顯微鏡(Olympus 公司)、5400 型CO2 培養(yǎng)箱(NAPCO公司)。
2 方法
2.1 毒死蜱完全抗原的合成與鑒定
2.1.1 半抗原合成
稱(chēng)取 1.06 克3-巰基丙酸(10mmol)于三口平底燒瓶，用50ml 無(wú)水乙醇溶解，加入NaOH1.0143 克，在磁力攪拌器上加熱攪拌反應(yīng)，直至溶解[9]。再加入溶于50ml 無(wú)水乙醇的毒死蜱原藥3.51 克(10mmol)，60℃下回流反應(yīng)2h，過(guò)濾反應(yīng)混合物，減壓濃縮。然后用5%NaHCO3 溶液50ml 將殘留物轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，正已烷(50ml×2)萃取2 次，棄去有機(jī)相。
然后用濃鹽酸調(diào)水相pH 至3 左右，二氯甲烷(50ml×3)萃取3 次，有機(jī)相過(guò)無(wú)水Na2SO4，減壓濃縮近干，得棕紅色油狀物，柱層析過(guò)硅膠柱，收集洗脫液(正己烷/乙酸乙酯,1：2)的流動(dòng)相，減壓濃縮近干。加入少量無(wú)水乙醇溶解產(chǎn)物，重結(jié)晶后得到淺黃色晶體。合成路線見(jiàn)?！ ?br />
2.1.2 人工抗原的合成
將 0.0843 克(半抗原200μmol)溶于2mlN,N-二甲基甲酰胺中，然后加入等當(dāng)量的二環(huán)已基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下磁力攪拌反應(yīng)過(guò)夜，離心收集上清液后，取500μl上清液加入6ml0.2M 硼酸鹽緩沖液(pH9.0)溶解的10mg/mlBSA 溶液中，常溫磁力攪拌下反應(yīng)4h；另取500μl 上清液加入到7ml0.2M 硼酸鹽緩沖液(pH9.0)溶解的15mg/mlOVA 溶液中，常溫磁力攪拌下反應(yīng)2h[6, 9]。前者合成物為免疫抗原，后者為包被抗原。
2.1.3 純化與鑒定合成抗原
凝膠過(guò)濾層析法純化免疫抗原和包被抗原，冷凍干燥，-20℃保存。紫外吸收光譜法鑒定合成抗原，鉬蘭比色法測(cè)定毒死蜱人工抗原結(jié)合比。
2.2 毒死蜱單克隆抗體的制備
2.2.1 小鼠免疫
將免疫抗原用PBS 緩沖液配制成1μg/μL 的溶液備用。取健康6-8 周齡雌性BALB/C 小鼠6 只，編號(hào)后按常規(guī)免疫方案分批免疫。第一次免疫，將免疫抗原PBS 溶液與等體積的弗氏完全佐劑充分混合，抽取混勻的乳液進(jìn)行腹腔多點(diǎn)注射，每只鼠的注射量為200μL；兩周后進(jìn)行第二次免疫，注射方法、注射體積不變，但改用弗氏不完全佐劑；以后按照第二次免疫方案以一周為間隔進(jìn)行免疫；第三次免疫一周后，從小鼠尾部取少量血，通過(guò)間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)；待效價(jià)至少達(dá)到1∶1000 后，于融合前三天取同量免疫抗原不加佐劑對(duì)小鼠進(jìn)行尾靜脈注射以強(qiáng)化免疫[10, 11]。
2.2.2 細(xì)胞融合
細(xì)胞融合當(dāng)天從小鼠尾靜脈采血測(cè)定抗血清效價(jià)，選擇血清抗體呈陽(yáng)性且效價(jià)較高者用于細(xì)胞融合。取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0 小鼠骨髓瘤細(xì)胞在50%聚乙二醇（PEG）作用下進(jìn)行融合。融合方案為約1min 加完50%PEG，前30 秒逐滴加入，后30 秒可稍快，吹打1min，靜置1.5min，然后逐滴加入RPMI-1640 培養(yǎng)基，約6min 完成，再緩慢加入10mLRPMI-1640培養(yǎng)基以終止PEG 作用，750g 離心5min，棄上清夜，將細(xì)胞輕輕懸于20mLRPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于CO2 培養(yǎng)箱待用。用RPMI-1640 培養(yǎng)基將飼養(yǎng)細(xì)胞配成2×105 個(gè)/mL 的懸浮液，將飼養(yǎng)細(xì)胞與融合細(xì)胞1∶1 混合，并轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)12-24h。最后750g 離心5min收集細(xì)胞，用50mLHAT 培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，分裝96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入0.2mL，置于37℃、5%CO2 飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.2.3 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選及克隆化
融合后每 3-4 天半量換液一次。2-3 天，骨髓瘤細(xì)胞明顯退化，5-7 后天待骨髓瘤細(xì)胞全部死亡，用HT 培養(yǎng)基取代HAT 培養(yǎng)基，每3-4 天半量換液一次。約6-7 天出現(xiàn)雜交瘤細(xì)胞克隆，細(xì)胞大、圓且透亮，在培養(yǎng)板的蓋板上畫(huà)上克隆生長(zhǎng)的標(biāo)記，記錄有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的孔數(shù)。采用間接ELISA 與競(jìng)爭(zhēng)ELISA 聯(lián)合應(yīng)用的方法對(duì)雜交瘤進(jìn)行篩選，先用間接ELISA對(duì)所有雜交瘤生長(zhǎng)孔的抗體進(jìn)行初篩，再對(duì)陽(yáng)性孔用競(jìng)爭(zhēng)ELISA 進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)，對(duì)特異性抗體陽(yáng)性孔的雜交瘤細(xì)胞以有限稀釋法進(jìn)行克隆和亞克隆，直至單克隆的雜交瘤克隆化后上清的陽(yáng)性率是100%，以獲得穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。擴(kuò)大培養(yǎng)篩選出的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，使用BALB/C 小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法大量制備單克隆抗體。采用正辛酸-硫酸銨沉淀法(CAASP)純化抗體，從純化后得到的單克隆抗體溶液中吸取80μL，用PBS 緩沖液稀釋至2mL，隨后用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定稀釋液在260nm 及280nm 處的吸光度，計(jì)算抗體含量。
2.3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法的建立
2.3.1 抗原抗體濃度的選擇
通過(guò)方陣法確定抗原抗體工作濃度，分別用0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL 濃度的包被抗原分組包被酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃冰箱包被過(guò)夜。封閉后，將純化后的單克隆抗體用PBS-T 液分別稀釋至0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL，每孔50μL 分組對(duì)應(yīng)加入封閉后的酶標(biāo)板，隨后每孔加入50μLPBS-T液，37℃溫箱中溫育1h。另設(shè)兩孔陰性血清(1∶100 倍稀釋)和空白對(duì)照(PBS-T)。甩干酶標(biāo)板，洗滌液PBS-T 洗滌3 次，每次5min， 吸水紙拍干。加入PBS-T 溶液1∶5000 倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶-羊抗小鼠IgG，每孔100μL，37℃溫箱中孵育1h。洗板后，每孔加入臨用前鮮配的底物(TMB)溶液100μL，避光置37℃溫箱15min，每孔加50μL2mol/L 的H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm 波長(zhǎng)處的各孔吸光值。
2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
用選定的工作濃度的包被抗原包被酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃包被過(guò)夜。待封閉酶標(biāo)板后每孔加入50μL 抗體稀釋液，隨后分組加入50μL 一系列梯度濃度的毒死蜱溶液(10-3~102μg/mL)及作為對(duì)照的PBS-T 溶液，每一濃度的毒死蜱溶液設(shè)三個(gè)平行，37℃溫箱中溫育1h，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 試驗(yàn)毒死蜱對(duì)單克隆抗體的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果吸光度后，以毒死蜱濃度為橫坐標(biāo)(以對(duì)數(shù)刻度形式表示)，抑制率為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，求出毒死蜱對(duì)單克隆抗體的抑制回歸方程和半數(shù)抑制濃度IC50 值(即當(dāng)抑制率為50%時(shí)的毒死蜱濃度)。其中：抑制率=（上述加不同毒死蜱濃度孔的吸光度值的3 孔平均值）/（對(duì)照孔的吸光度值的3 孔平均值）×100%。
2.3.3 單克隆抗體特性鑒定
取克隆化后的細(xì)胞株培養(yǎng)上清檢測(cè)，分別用0.5μg 的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b 和IgG3包被酶標(biāo)板，間接ELISA 鑒定單克隆抗體亞類(lèi)。
2.3.4 交叉反應(yīng)
性按照毒死蜱間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 試驗(yàn)檢測(cè)條件分別對(duì)殺螟硫磷、對(duì)硫磷和馬拉硫磷等與毒死蜱結(jié)構(gòu)相似的有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。將上述農(nóng)藥按一定濃度梯度稀釋,建立它們的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各自的IC50，按下述公式計(jì)算交叉反應(yīng)率：交叉反應(yīng)率=(毒死蜱對(duì)單克隆抗體的IC50/其它試驗(yàn)農(nóng)藥的IC50)×100%
3 結(jié)果
3.1 毒死蜱完全抗原鑒定
紫外掃描光譜結(jié)果（200～360nm）見(jiàn)表1，合成的免疫抗原和包被抗原與載體蛋白BSA、OVA 相比，最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生發(fā)生明顯的變化，向遠(yuǎn)紫外區(qū)偏移；免疫抗原和包被抗原與毒死蜱半抗原最大吸收波長(zhǎng)也不一致，這表明合成抗原與載體蛋白及毒死蜱半抗原不是同一種物質(zhì)，間接說(shuō)明人工抗原的合成是成功的。
3.2 毒死蜱半抗原與載體蛋白結(jié)合比的測(cè)定
以系列濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值為縱坐標(biāo)，磷濃度為橫坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸光度值對(duì)磷濃度的回歸方程y=0.4525x-0.0085。隨后根據(jù)回歸方程求出完全抗原溶液的磷濃度，按式計(jì)算合成抗原中磷含量及偶聯(lián)結(jié)合比。免疫抗原和包被抗原中載體蛋白與毒死蜱偶聯(lián)結(jié)合比分別為1：64 和1：19。
3.3 毒死蜱單克隆抗體的制備
免疫抗原免疫 BALB/C 小鼠，小鼠的血清效價(jià)以間接ELISA 法檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)表示，結(jié)果顯示效價(jià)最高者可達(dá)1∶20000。選擇血清效價(jià)高者用于細(xì)胞融合以制備單克隆抗體。
細(xì)胞融合5~7 天左右，倒置顯微鏡下可見(jiàn)大量未融合的細(xì)胞明顯退化、縮小，逐漸死亡，并可見(jiàn)有小的雜交瘤細(xì)胞克隆出現(xiàn)，雜交瘤細(xì)胞大、圓且透亮，以后克隆逐漸長(zhǎng)大，約兩周后可長(zhǎng)至培養(yǎng)孔底1/5 以上。融合細(xì)胞一共接種151 孔，其中44 孔有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，融合率為29.13%。間接ELISA 檢測(cè)，陽(yáng)性細(xì)胞孔5 孔，陽(yáng)性率為3.31%，陽(yáng)性孔與陰性血清孔的吸光度值之比最高達(dá)到12。
對(duì)篩選出的5 孔陽(yáng)性孔細(xì)胞進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)，挑選出其中陽(yáng)性吸光度值較高、抑制效果較明顯的細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法克隆或亞克隆，最終得到2 株能穩(wěn)定分泌毒死蜱抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。采用正辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水，得到的單克隆抗體溶液稀釋后，使用紫外分光光度法測(cè)定抗體濃度為4.08mg/mL。間接ELISA 表明，2 株細(xì)胞分泌的抗毒死蜱單克隆抗體均為IgG1 型蛋白。
3.4 間接ELISA 試驗(yàn)最適工作濃度
用方陣試驗(yàn)對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 法的抗原、抗體的工作濃度進(jìn)行篩選和確定，結(jié)果見(jiàn)表2。挑選能使吸光度值在1.0 左右而本身值均較小的抗原和抗體的濃度作為間接ELISA 試驗(yàn)的工作濃度。由表4 選擇間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 試驗(yàn)的最適工作濃度是：包被抗原為1μg/ml，抗體為0.4μg/ml。
3.5 毒死蜱對(duì)純化后抗體的抑制曲線和檢測(cè)靈敏度
以系列濃度的毒死蜱溶液做間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 試驗(yàn)，根據(jù)抑制率與毒死蜱濃度之間的關(guān)系作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)回歸方程y=-0.2669Ln(x)-0.0347，(R2=0.9859)，得出其半數(shù)抑制濃度IC50 為0.135μg/mL，線性檢測(cè)范圍為0.04～0.42μg/mL，最低檢測(cè)限為0.03μg/mL。
3.6 單克隆抗體特異性研究
分別對(duì)毒死蜱及殺螟硫磷、對(duì)硫磷、馬拉硫磷做間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3，這三種農(nóng)藥與毒死蜱的交叉反應(yīng)率分別小于0.09%、0.14%、0.05%。
4 討論
毒死蜱屬于小分子物質(zhì)，其自身不具備免疫原性，必須先與免疫原性較強(qiáng)的大分子物質(zhì)相偶聯(lián)，制備人工抗原，才能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。人工抗原的合成是農(nóng)藥殘留免疫分析中制備抗體和建立免疫分析方法的關(guān)鍵步驟，而半抗原的合成則是人工抗原合成的前提。農(nóng)藥分子半抗原設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)使半抗原最大限度的保留農(nóng)藥分子的特征化學(xué)結(jié)構(gòu)，以便農(nóng)藥分子能被免疫活性細(xì)胞所識(shí)別，制備出特異性強(qiáng)，親和力高的抗體。本研究選擇在苯環(huán)上引入活性基團(tuán)羧基，采用碳二亞胺法合成毒死蜱免疫抗原和包被抗原，經(jīng)紫外光譜掃描鑒定后，間接證明成功合成人工抗原。合成的毒死蜱免疫抗原與包被抗原中載體蛋白與毒死蜱的結(jié)合比分別為1∶64 與1∶19，與相關(guān)文獻(xiàn)相比結(jié)合比稍偏大。但是人工抗原的結(jié)合比大小沒(méi)有絕對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)，各報(bào)道也不一致[13]，人工抗原的結(jié)合比稍大，將有更多的半抗原分子可以暴露在外面，理論上將增加機(jī)體產(chǎn)生抗毒死蜱抗體的能力。
在農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境農(nóng)藥殘留分析中，單克隆抗體與常規(guī)抗體相比有如下優(yōu)點(diǎn)：①單一特異性，只與同一抗原決定簇反應(yīng)，不易產(chǎn)生交叉反應(yīng)；②可重復(fù)性，由于來(lái)自統(tǒng)一細(xì)胞，能夠提供完全一樣的抗體制劑，易于標(biāo)準(zhǔn)化管理；③一經(jīng)制出，可無(wú)限量地供應(yīng)，適宜規(guī)?；a(chǎn)；④生產(chǎn)單克隆抗體，可以用不純的抗原作為免疫原；⑤能查出混合物中存在的用常規(guī)方法查不出的少量成分。由于McAb 具有特異、靈敏、快速、簡(jiǎn)便、痕量檢測(cè)以及可大批量樣本檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，日益顯示出強(qiáng)大的應(yīng)用價(jià)值和前景。基于單克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種免疫測(cè)定技術(shù)，它是一種在固相載體上進(jìn)行的免疫酶反應(yīng)，其檢測(cè)核心是利用抗原抗體之間的特異性吸附，在固相載體上層層疊加，可以是2 層、3 層甚至更多層，而只進(jìn)行一次酶促反應(yīng)使底物顯色，從而對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量或定性分析。它可特異、快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)農(nóng)藥殘留，尤其適用于現(xiàn)場(chǎng)控制農(nóng)藥、蔬菜、水果中的農(nóng)藥殘留，對(duì)發(fā)展無(wú)污染農(nóng)產(chǎn)品，保障人體健康發(fā)揮著重要作用。本研究初步建立了檢測(cè)毒死蜱的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法，半數(shù)抑制濃度IC50 為0.135μg/mL，線性檢測(cè)范圍為0.04～0.42μg/mL，最低檢測(cè)限為0.03μg/mL，低于常規(guī)氣相色譜法對(duì)毒死蜱的儀器檢出限0.05mg/L。特異性研究結(jié)果表明制備的單克隆抗體與殺螟硫磷、對(duì)硫磷和馬拉硫磷三種與毒死蜱結(jié)構(gòu)相似的有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥幾乎沒(méi)有交叉反應(yīng)，該單克隆抗體特異性較好。
本研究初步建立的間接ELISA 法檢測(cè)毒死蜱的半數(shù)抑制濃度IC50，與其他研究者[6, 12]
制備的毒死蜱多克隆抗體相比，靈敏度相當(dāng)；與國(guó)外的毒死蜱單克隆抗體相關(guān)研究結(jié)果比較[11, 12]，本研究ELISA 試驗(yàn)的靈敏度相對(duì)偏低，兩者相差了1 個(gè)數(shù)量級(jí)，與國(guó)內(nèi)相比[14]，靈敏度相當(dāng)。分析靈敏度與國(guó)外研究結(jié)果相比偏低的原因可能由于ELISA 反應(yīng)體系中影響因素較多：包被抗原及抗體的濃度，酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)，反應(yīng)的溫育時(shí)間，洗滌次數(shù)，緩沖液的pH 值，封閉液的選擇等都會(huì)對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果有影響，而本研究?jī)H對(duì)不同的包被抗原和抗體濃度方面進(jìn)行了研究篩選，因此可能尚沒(méi)有摸索出該抗體ELISA 的最佳反應(yīng)條件，如果繼續(xù)就以上因素進(jìn)一步優(yōu)化，試驗(yàn)靈敏度會(huì)有所提高。而且本次試驗(yàn)中所用毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液是以毒死蜱原藥配制的，純度只有98.8%，如果換用高純度的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品配制，也會(huì)提高試驗(yàn)靈敏度。此外因?yàn)樾∈蟾顾须s蛋白，只采用正辛酸-硫酸銨沉淀一步純化法，不可能得到高純度的抗體，將此純化后的抗體再過(guò)一次DEAE 離子交換層析柱或羥基磷灰石柱，或者直接進(jìn)行免疫親合層析純化將會(huì)得到更純的抗體，這也將有助于提高ELISA 試驗(yàn)的靈敏度。因此，本研究應(yīng)進(jìn)一步提高該方法的靈敏度，并對(duì)準(zhǔn)確度、精密度和重復(fù)性做深入的研究分析，為開(kāi)發(fā)檢測(cè)毒死蜱的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。
中國(guó)醫(yī)學(xué)論文網(wǎng)專(zhuān)業(yè)提供醫(yī)學(xué)論文發(fā)表服務(wù)，并提供大量中藥學(xué)論文，如有業(yè)務(wù)需求請(qǐng)咨詢(xún)網(wǎng)站客服人員！
[參考文獻(xiàn)] (References)
[1] 宋歡, 薛園園, 林勤保. 色譜法分析氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)分析計(jì)量, 2009, 18(3):86-88
[2] 趙輝. 番茄和蘋(píng)果中14 種有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量的毛細(xì)管氣相色譜檢測(cè)[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 26(2): 734-738
[3] 孫軍, 潘玉香. 氣相色譜雙塔雙柱同時(shí)測(cè)定蔬菜中多種有機(jī)氯及擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量[J]. 分析試驗(yàn)室, 2007, 26(8): 56-60
[4] 劉俊花. 有機(jī)磷農(nóng)藥免疫檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2009, 182(8): 57-58
[5] 高俊娥, 李盾, 劉銘鈞. 農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥, 2007, 46(6): 361-364
[6] 吳剛, 黃雅麗, 朱國(guó)念, 等 有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑毒死蜱的免疫化學(xué)分析方法研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004,37(3):382-386
[7] 王金花, 陸貽通. 農(nóng)藥毒死蜱的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)及其微生物修復(fù)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境污染與防治, 2006, 28(2):125-127
[8] 姜書(shū)凱. 毒死蜱產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和前景[J]. 農(nóng)藥研究與應(yīng)用, 2008, 12(3): 1-3
[9]朱國(guó)念, 吳剛, 吳慧明. 有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑毒死蜱人工抗原的合成與鑒定[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 36（6）：657 - 662
[10] Manclus J J, Primo J, Montoya A. Development of enzyme-linked immunosorbent assays for the insecticideChlorpyrifos. 1. monoclonal antibody production and immunoassay design[J]. Journal of Agricultural and FoodChemistry, 1996 ,44: 4052- 4062
[11] Manclus J J, Primo J, Montoya A. Development of enzymelinked immunosorbent assays for the insecticideChlorpyrifos.2.Assay optimization and application to environmental waters[J]. Journal of Agricultural & FoodChemistry, 1996,44：4063-4070.
[12] 韓麗君, 錢(qián)傳范, 李文明, 等. 酶聯(lián)免疫吸附分析法測(cè)定土壤中的毒死蜱[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 8:53-55
[13] Chen PS, Tonbara TY, Wamer H. Microdetermination of phosphorus. Anal. Chem. 1956, 28(11): 1756-1758
[14] 吳雅欣, 許園園, 潘家榮. 毒死蜱單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2009, 23(2): 341-344
胚胎冷凍儀(程序降溫儀） （點(diǎn)擊進(jìn)入）
專(zhuān)業(yè)有效的細(xì)胞涂片系統(tǒng) 離心機(jī)---來(lái)自德國(guó) （點(diǎn)擊進(jìn)入）
